甲磺酸培氟沙星
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培氟沙星毒性预测与实验数据比较研究
Compare study on the toxicity prediction and experimental data of pefloxacin
导读
武英豪，程林丽，沈建忠，胡烨，刘莹莹
中国农业大学动物医学院
摘要
培氟沙星(简称PFLX)是目前活性最强、临床疗效最好的氟喹诺酮类药物，也是典型的人兽共用化学合成药。但是，培氟沙星具有一定的毒性，它用于畜牧生产时可能会残存于动物性食品中，从而通过食物链危害人类的身体健康。
文章的目的是利用计算机辅助药物设计技术，对培氟沙星进行毒性预测，分析和讨论预测值与文献发表的传统实验数据的吻合度和差异，以期能够为该药的毒理学研究和兽药安全性评价提供参考和帮助。
正文
培氟沙星（Pefloxacin，结构式见图1）为甲基-4-哌嗪喹诺酮类衍生物，属于第三代喹诺酮类化合物。
它是一种高效、低毒、人兽通用的广谱抗菌药物，以吸收快、生物利用度好、组织药物浓度高、体内分布广、维持时间长为特点，临床应用主要是其甲磺酸盐。
培氟沙星在动物体内对革兰氏阴性菌的抗菌活性与第三代头孢菌素及新氨基糖苷类相似，对衣原体、支原体、某些革兰氏阳性菌也有一定的抗菌作用。它通过干扰DNA的复制以及菌体蛋白的合成而发挥抑制或杀灭细菌的作用。
毒性研究是对兽药进行安全性评价的重要内容。传统的毒理学评价方法一般包括三性（急性、亚慢性、慢性毒性）试验和三致（致突变、致畸、致癌）试验，以预测新兽药的安全性。这些评价方法都采取传统的毒理学试验进行。
而近年来定量构效关系(QSAR)逐渐成为一项分析化合物的药理和毒理性质非常有用的方法。它借助分子的理化性质参数或结构参数，以数学和统计学手段定量研究有机小分子与生物大分子相互作用，构建相关预测模型，测定类似结构化合物的药理和毒理性质，在药物设计研究中发挥重要的作用。而在对已有药物的研究中目前还少见应用。
因此，本研究的目的是利用计算机辅助药物设计技术，对培氟沙星进行毒性预测，分析和讨论各个毒性参数与文献发表的传统实验数据的吻合度和差异，以期能为该药的毒理学研究和食品安全性评价提供有力的参考和佐证。
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材料与方法
试验以量子力学、分子力学、分子动力学、定量构效关系、分子与结构生物学、化学生物信息学、计量化学等为理论基础，在Windows XP操作系统(美国微软公司）中安装ADMET Predictor 6.5商业软件进行毒性预测。
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测定方法
2.1 急性毒性测定
进行LD50值预测和比较分析。大鼠的急性毒性模型建立在药物对大鼠的LD50 实验值的基础上，以mg/kg级计量口服给药的化合物对大量的大鼠进行试验，获得7 510种具有独特的毒性识别位点的化合物的LD50值，进行pLD50或以mol/kg单位的LD50的负对数值ANNE模型法二维和三维模式建模。
急性毒性参数TOX_Rat的预测值用半数致死浓度LD50表示，单位为mg/kg。对于大多数药物分子，TOX_Rat的预测值应大于或等于300才能判定为无急性毒性。
2.2 皮肤过敏性测定
建模数据来自298个化合物的小鼠局部淋巴结试验（LLNA）结果。在二维模型构建过程中抽取20%的化合物用作训练集，而在三维模型构建中则抽取30%的化合物，2D模式和3D模式下实验值与预测值的相关性依次为92.1%和87.6%。
用致敏性或非致敏性来表示皮肤过敏性参数TOX_SKIN。EC3是LLNA的端点。
通过与阴性对照组比较，将能使大鼠体内产生淋巴结细胞增殖刺激作用的化合物最低浓度的3倍剂量用来区分致敏作用和非致敏作用。
化合物具有皮肤致敏性的标准是其EC3值≤10%，EC3值大于10%则被认为无皮肤致敏性。
2.3 致癌性测定
分别进行大鼠致癌性和小鼠致癌性测定。大鼠和小鼠ADMET Predictor致癌性定量构效关系模型建立在CPDB数据库的基础上，拥有较好的有效性。
以半数致癌浓度TD50来表示致癌性大鼠模型参数TOX_BRM_Rat，单位为mg/(kg·d)。在整个生命期间50%种群数量的大鼠产生肿瘤细胞时口服化合物的剂量称之为TD50。大多数药物分子的TOX_BRM_Rat预测值大于或等于4。
以半数致癌浓度TD50 来表示致癌性小鼠模型参数TOX_BRM_Mouse，单位为mg/(kg·d)。在整个生命期间50%种群数量的小鼠产生肿瘤细胞时口服化合物的剂量称之为TD50。大多数药物分子的TOX_BRM_Mouse预测值大于或等于25。
2.4 对染色体变异的影响测定
进行是否诱导产生染色体变异的预测和比较分析。预测模型来自于1 407种化合物的染色体变异毒性分析值构建的神经网络集成模型。
训练集数据毒性结果的得出采用的是传统的染色体突变试验。致染色体变异可能性参数为TOX_CABR，其预测结果为“是”和“否”两种。
2.5 生殖毒性测定
进行生殖毒性的预测和比较分析。软件的建模数据来自116 种被认为具有生殖毒性的化合物数据。
建立的分类模型先对254种训练集/毒性集化合物进行分析，之后再对38种实验数据集分析，其结果均获得了87% 以上的相似度。生殖毒性参数TOX_REPR的预测结果为“是”和“否”两种。
2.6 致突变性测定
进行致突变作用的预测和比较分析。共用10株不同沙门属的Ames 试验进行致突变性参数TOX_MUT_***测定。
10 个TOX_MUT_***的模型均为定性测定，这种模型的测定结果有“阳性”和“阴性”两种。致突变性风险评估参数TOX_MUT_Risk可以在通过对化合物的TOX_MUT_***预测结果进行综合打分之后进一步获得。该值对于大多数药物分子而言，应小于或等于2。10株沙门氏菌见表1。
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结果分析与讨论
作为药物研究中一个广泛的课题，药物的化学结构与生物活性(包括药理和毒理)之间的关系一直备受关注。
药物小分子与生物大分子的物理化学性质和化学结构间相互适配，进而药物在机体内与相应的部位发生作用，产生生物活性。
药物分子结构的改变，其活性发生强度和活性类型会相应改变。通过对构效关系的研究，建立二者之间变化的规律性，以此可以对类似化合物进行预测。
将由此得到的预测结果与实验数据进行比较，则能从药物的化学结构的角度为该药物的毒理学评价提供更多、更可靠的佐证。
3.1 培氟沙星的急性毒性比较分析
急性毒性是衡量化合物毒性的重要指标。化合物的急性毒性数据在动物性试验中一般指大鼠的半数致死浓度LD50。
联合国世界卫生组织为方便对急性毒性进行评价，推荐了一个五级标准。在此分级标准的基础上，一种与此基本相同但更具体的6级标准由我国提出。
该标准规定LD50值（mg/kg）：<1，6级，极毒；1~50，5级，剧毒；51~500，4级，中等毒；501~5 000，3级，低毒；5 001~15 000，2级，实际无毒；>15 000，1级，无毒。
判定化合物为无急性毒性在本研究使用的预测软件的参数要求是TOX_Rat值应大于或等于300。软件测得培氟沙星的大鼠急性毒性为331.58 mg/kg，按预测软件的标准，培氟沙星TOX_Rat预测值≥300 mg/kg，没有急性毒性。
按我国的分级标准，其毒性值位于51~500的范围，属中等毒性。也就是说，通过化合物的结构、理化性质等参数建立起的该数学模型预测结果用我国传统的毒性分级标准分类属中等毒性。
Sridevi 等（2002）研究了培氟沙星对幼犬的毒性，结果表明，以10 mg/kg体重给药时，给药方式为一天两次，连续30 d给药，最后未发现明显的毒性作用。
Ashish等（2000）研究了培氟沙星对肉用仔鸡的毒性，测得的LD50为1 025 mg/kg。
Af等（2015）所做的实验发现，新型氟喹诺酮类对BALB/C小鼠模型的急性毒性的LD50≥5 000 mg/kg。
史晓丽等（1998）以昆明种小鼠进行急性毒性试验，20 只小鼠饲养数日，禁食一夜，于翌晨称重，随机分为4组(雌、雄各半)，最大剂量为2 000 mg/kg 体重，按等比级数递减，经口一次给药，在一周内观察中毒症状，记录各组的死亡率，用移动平均法计算LD50 和95%的可信限。
测得甲磺酸培氟沙星对小鼠的急性毒性经口LD50为1 690 mg/kg(1 326~2 148 mg/kg)。采用FDA 颁布的动物与动物之间剂量换算方法，将小鼠的实验结果换算成大鼠的LD50剂量为845 mg/kg,与预测值331.58 mg/kg有差距。
造成差距的原因可能是，预测结果建立在化合物的化学结构和理化参数的基础上，而化合物的脂溶性(logP)、水溶性(Sw)和渗透性(Peff)也是影响化合物毒性的重要因素。在培氟沙星的实际应用过程中，后面这些因素极大地降低了药物的毒性作用。
3.2 培氟沙星的皮肤过敏性比较分析
皮肤致敏性属于急性毒性的一种。分析预测化合物是否会产生皮肤过敏反应，TOX_SKIN 采用LLNA，其预测值用致敏性或非致敏性表示。采用软件预测结果认为，培氟沙星无致敏性。
毛永利等(2007)进行了复方奥硝唑甲磺酸培氟沙星缓释制剂（每枚重10 mg，含原药量1 mg）的豚鼠皮肤过敏性实验。
结果表明，缓释牙栓组动物自给药72 h内未出现红斑及水肿，与空白对照组无差异；基质组无致敏现象；阳性对照组动物皮肤受试区自激发给药6 h后，有明显轻度红斑出现，无水肿，致敏率100%。由此可见缓释剂不产生致敏作用。该报道的实验值与软件预测值一致，进一步佐证了培氟沙星不产生皮肤致敏性。
3.3 培氟沙星的致癌性比较分析
大鼠致癌性试验和小鼠致癌试验为目前致癌性的主要表征。大鼠和小鼠服用某些化学物质后可以诱导癌症。
同种化学物质对不同体型的鼠的致癌效果不同，部分化学物质，尤其是一些在大鼠模型中呈阴性的兽用化学品，在小鼠模型中则有诱导肝脏肿瘤的毒性。
不用考虑化学物质的相关性和基础机理，不管何种反应现象出现，只要化学物在任一测试中测出具有诱导癌症的毒性，则被认为是致癌物，且即可横向推得结论认为该化学物质对人类也存在致癌风险。
ADMET Predictor对两种试验结果均进行了相应的数学预测。结果表明：培氟沙星大鼠模型的半数致癌浓度为2.39 mg/(kg·d)，小于大鼠模型无致癌性的最低值，预测培氟沙星对大鼠有致癌性。
培氟沙星小鼠模型半数致癌浓度为139 mg/(kg·d)，符合小鼠模型无致癌性的参数要求，预测培氟沙星对小鼠无致癌性。
3.4 培氟沙星对染色体变异的比较分析
通过预测获得培氟沙星没有致染色体变异的可能性。刘宁（2011）采用健康成年昆明小鼠进行染色体突变实验。
按小鼠对药物的最大耐受量10 g/kg为最高给药剂量进行灌胃，依次为5、2.5 g/kg 以及1.25 g/kg。单次给药24 h后取胸骨骨髓挤压制片，油镜计数嗜多染红细胞中的微核数，计算微核诱发率和幼红细胞之比。
结果认为，复方奥硝唑甲磺酸培氟沙星缓释制剂不引起小鼠骨髓微核增多，说明此药对哺乳类动物细胞染色体无影响，不引起染色体损伤而导致遗传毒性。该实验结果与软件预测结果相符。
3.5 培氟沙星的生殖毒性比较分析
软件预测得出培氟沙星没有生殖毒性，并且不产生雌雄激素受体结合毒性。
董正谋等（2011）对雌性大鼠根据体质量每天按1、4、8 g/kg的剂量灌服复方奥硝唑甲磺酸培氟沙星牙周缓释制剂处理，发现雌性大鼠从交配前至胚胎着床期服用该药对其一般情况、交配能力、受孕力、子宫和早期胚胎的黄体数、着床数、活胎数、死胎数、吸收胎数均无不良影响，而高剂量可引起卵巢质量减轻、系数减小和形态学改变，因此认为该药对雌性大鼠无生殖毒性。
对雄性大鼠的相关实验则表明，药剂处理对其一般情况、交配能力和生育能力无不良影响，而高剂量可引起大鼠体质量减轻，睾丸、附睾质量减轻系数减小，精子活动力降低、数目减少和畸形率升高，同时导致睾丸、附睾组织病理学改变，即药物对雄性大鼠亦无生殖毒性。
3.6 培氟沙星致突变性分析
Ames试验是一个短期的细菌回复突变试验，也是目前微生物检测药物致突变最常见的方法，它能检测多种因化学诱导致遗传损伤的可能使人类致癌的化合物。
判断受试药物有无诱变性是依据加入被测药物平皿中回变生长的菌落数并与自发对照平皿中的菌落数相比较得出的，即在本试验中所选用的TA系列菌株是组氨酸合成缺陷型菌株，在组氨酸含量微小的培养基上，这种细菌仅能分裂几次，只能形成背景，不能形成菌落。
当这些菌株被诱变剂作用之后，在一定条件下，就可能发生回复突变而变成具有野生型生物学特征的原养型菌株，这些菌株就可在组氨酸缺乏的情况下，应用培养基中所含有的其他成分自我合成组氨酸，使得可以继续生长分裂最终形成菌落。
刘宁（2011）做的致突变性的实验结果表明：复方奥硝唑甲磺酸培氟沙星缓释制剂不存在致突变性。
在有无代谢活化剂S9的情况下，其各剂量组与阴性对照组均无显著性差异，而经阳性诱导剂诱导的回复突变的菌落数目均远大于阴性对照组的2倍以上，呈明显的阳性结果，且活化平板掺入试验中菌落回变数并未比非活化平板掺入试验有明显增加，因而该药物无致突变性。
软件预测培氟沙星的致突变性为3，即有少量的致突变性，与实验的不致突变相矛盾。可能是由于实验所用的沙门菌的菌株特点与软件所设定的不同，并且试验中加入了活化系统。
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结论
预测培氟沙星是否具有急性毒性，软件的预测值为331.58 mg/kg,根据软件的评估，只要预测值大于或等于300 mg/kg,即可说明测定的化合物无急性毒性。
但是根据我国对急性毒性评价标准，331.58 mg/kg属于51~500，四级，中等毒性。文献查找的结果是培氟沙星的急性毒性的值为1 690 mg/kg，换算后的数据与真实值的差距造成的主要原因可能是大鼠和小鼠的差别。
培氟沙星是否会导致皮肤过敏，软件预测为nontoxic，即该化合物不会导致皮肤过敏，和文献查找的数据一样，因此可以说软件对结果进行了正确的预测。
预测培氟沙星是否具有致癌性，根据实验对象的不同，软件预测大鼠的TD50为2.39 mg/(kg·d)，小于无致癌性的最低值4 mg/(kg·d)，所以预测培氟沙星对大鼠有致癌性。
软件预测小鼠的TD50为139 mg/(kg·d)，大于小鼠无致癌性的最低值25 mg/(kg·d)，所以预测培氟沙星对小鼠无致癌性。因为目前为止并未找到相关文献的佐证，所以软件对结果是否进行了正确的预测不得而知。
预测培氟沙星是否具有生殖毒性，软件预测无生殖毒性。文献记载的实验结果为无生殖毒性，但是高剂量组会对一系列的生殖器官和相关系数造成不良影响。从很大程度上说可以认为软件对结果进行了正确的预测。
预测培氟沙星是否具有致突变性，软件预测该化合物具有小可能的致突变性，与文献报道的无致突变性相矛盾。造成这种不一致的原因可能是由于实验所用的沙门菌的菌株特点与软件所设定的不同，并且试验中加入了活化系统。所以针对致癌性软件的预测不是很准确的。
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来源：试验研究 2017年第38卷第20期总第545期
